R实战 | 置换多元方差分析（以PCoA的PERMANOVA分析为例）

置换多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA），又称非参数多因素方差分析（nonparametric multivariate analysis of variance）、或者ADONIS分析。它利用距离矩阵(如欧式距离、Bray-Curtis距离)对总方差进行分解，分析不同分组因素或不同环境因子对样品差异的解释度，并使用「置换检验」对各个变量解释的统计学意义进行显著性分析。

一个例子

比如，对宏基因组检测的物种丰度数据进行PCA/NMDS/PCoA降维可视化后，不同组的样品之间存在一些重叠，那怎么判断这些组之间的样品构成是否存在显著差别呢？这就需要用到PERMANOVA检验了，检验不同组的样品中心点是否重叠。

以上面的PCoA图为例，椭圆圈出的四组样品点正好对应四个海拔分组，这四组样品之间的群落差异是否显著呢？检验组间群落差异本质上是检验距离矩阵之间的差异，普通的ANOVA分析无能为力。而基于距离矩阵的PerMANOVA分析则表明，这四个分组两两之间差异是显著的(p<0.05)。

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Rui J, Li J, Wang S, et al. Responses of Bacterial Communities to Simulated Climate Changes in Alpine Meadow Soil of the Qinghai-Tibet Plateau. Appl Environ Microbiol. 2015;81(17):6070-6077. doi:10.1128/AEM.00557-15

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实战

PCoA

# Load package
library(vegan)
library(ggplot2)
library(ggthemes)
# Load data
otu <- read.table('otu.txt',row.names = 1,header = T)
group <- read.table('group.txt',header = T)
#pcoa
# vegdist函数，计算距离；method参数，选择距离类型
distance <- vegdist(otu, method = 'bray')
# 对加权距离进行PCoA分析
pcoa <- cmdscale(distance, k = (nrow(otu) - 1), eig = TRUE)
## plot data
# 提取样本点坐标
plot_data <- data.frame({pcoa$point})[1:2]
# 提取列名，便于后面操作。
plot_data$ID <- rownames(plot_data)
names(plot_data)[1:2] <- c('PCoA1', 'PCoA2')
# eig记录了PCoA排序结果中，主要排序轴的特征值（再除以特征值总和就是各轴的解释量）
eig = pcoa$eig
#为样本点坐标添加分组信息
plot_data <- merge(plot_data, group, by = 'ID', all.x = TRUE)
head(plot_data)
# 计算加权bray-curtis距离
dune_dist <- vegdist(otu, method="bray", binary=F)
dune_pcoa <- cmdscale(dune_dist, k=(nrow(otu) - 1), eig=T)
dune_pcoa_points <- as.data.frame(dune_pcoa$points)
sum_eig <- sum(dune_pcoa$eig)
eig_percent <- round(dune_pcoa$eig/sum_eig*100,1)
colnames(dune_pcoa_points) <- paste0("PCoA", 1:3)
dune_pcoa_result <- cbind(dune_pcoa_points, group)
head(dune_pcoa_result)
library(ggplot2)
ggplot(dune_pcoa_result, aes(x=PCoA1, y=PCoA2, fill=group)) +
  geom_point(shape = 21,color = 'black',size=4) +
  stat_ellipse(level=0.95)+
  scale_fill_manual(values = c('#73bbaf','#d15b64','#592c93'))+
  labs(x=paste("PCoA 1 (", eig_percent[1], "%)", sep=""),
       y=paste("PCoA 2 (", eig_percent[2], "%)", sep=""))  +
  theme_classic()

PERMANOVA

# 基于bray-curtis距离进行计算
dune.div <- adonis2(otu ~ group, data = group, permutations = 999, method="bray")
dune.div
library(ggalt)
dune_adonis <- paste0("adonis R2: ",round(dune.div$R2,2), "; P-value: ", dune.div$`Pr(>F)`)
p <- ggplot(dune_pcoa_result, aes(x=PCoA1, y=PCoA2, fill=group)) +
  geom_point(shape = 21,color = 'black',size=4) +
  stat_ellipse(level=0.95)+
  scale_fill_manual(values = c('#73bbaf','#d15b64','#592c93'))+
  labs(x=paste("PCoA 1 (", eig_percent[1], "%)", sep=""),
       y=paste("PCoA 2 (", eig_percent[2], "%)", sep=""),
       title=dune_adonis)  +
  theme_classic()
p

配对Adonis

# 配对Adonis确定两两分组之间对物种组成差异的影响
#devtools::install_github("pmartinezarbizu/pairwiseAdonis/pairwiseAdonis")
library(pairwiseAdonis)
dune.pairwise.adonis <- pairwise.adonis(x=otu, factors=group$group, 
                                        sim.function = "vegdist",
                                        sim.method = "bray",
                                        p.adjust.m = "BH",
                                        reduce = NULL,
                                        perm = 999)
library(ggpubr)
library(patchwork)
tab2 <- ggtexttable(dune.pairwise.adonis[,c("pairs","R2","p.value","p.adjusted")], rows = NULL, 
                    theme = ttheme("blank")) %>% 
  tab_add_hline(at.row = 1:2, row.side = "top", linewidth = 1)  %>% 
  tab_add_hline(at.row = nrow(dune.pairwise.adonis)+1, row.side = "bottom", linewidth = 1)  
p + tab2  + plot_layout(design=c(area(1,1), area(2,1)))

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